ヒトXY染色体FISHプローブ　FISHプロトコル

＜試薬＞
FISHプローブ
ホルムアミド
エタノール
パラホルムアルデヒド
ペプシン

＜切片の前処理＞
（凍結切片）
１．切片を室温に戻し、氷冷４％PFA／PBSで30分固定 PBSで十分に洗浄
２．0.02%〜0.5%ペプシン／0.1N塩酸溶液中で37℃、１分〜30分反応
３．PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥
（パラフィン包埋切片）
１．脱パラ
２．２×SSC中５分浸漬
３．２×SSC中、10分間電子レンジで加熱
４．PBS中で放冷 0.02%〜0.5%ペプシン／0.1N塩酸溶液中で37℃、１分〜30分反応
５．PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥

＜ハイブリダイゼーション＞　
６．切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける
７．凍結切片80℃、パラフィン切片80〜90℃のホットプレート上で10分間加熱し変性処理する
８．湿潤箱で37℃でovernightハイブリダイズさせる

＜洗浄・検出（ダイレクト蛍光標識プローブ）＞
９．２×SSC中５分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
10．50％ホルムアミド／２×SSC中、46℃、20分浸漬
11．１×SSC中15分浸漬
12．DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
13．蛍光観察

＜洗浄・検出（ハプテン標識プローブ）＞
９．２×SSC中５分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
10．50％ホルムアミド／２×SSC中、46℃、20分浸漬
11．１×SSC中15分浸漬
12．Blocking溶液にて30分間Blocking（5% milkまたは1% BSA in ４×SSCなど ）
13．蛍光標識avidinもしくは蛍光標識streptavidin ／blocking溶液で30分〜１時間反応
14．0.1% Nonidet P-40 (0.05% Tween20)／４×SSCで10分×２回、４×SSCで10分×1回洗浄
15．DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
16．蛍光観察