組織切片FISHプロトコル
試薬
- FISHプローブ
- ホルムアミド
- エタノール
- パラホルムアルデヒド
- ペプシン
切片の前処理
（凍結切片）
- 切片を室温に戻し、氷冷４％PFA／PBSで30分固定 PBSで十分に洗浄
- 0.02%〜0.5%ペプシン／0.1N塩酸溶液中で37℃、１分〜30分反応
- PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥
（パラフィン包埋切片）
- 脱パラ
- ２×SSC中５分浸漬
- ２×SSC中、10分間電子レンジで加熱
- PBS中で放冷 0.02%〜0.5%ペプシン／0.1N塩酸溶液中で37℃、１分〜30分反応
- PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥
ハイブリダイゼーション
- 切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける
- 凍結切片80℃、パラフィン切片80〜90℃のホットプレート上で10分間加熱し変性処理する
- 湿潤箱で37℃でovernightハイブリダイズさせる
洗浄・検出（ダイレクト蛍光標識プローブ）
- ２×SSC中５分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
- 50％ホルムアミド／２×SSC中、37℃、20分浸漬（ヒトＸＹプローブ・ラットＹプローブの場合46℃）
- １×SSC中15分浸漬
- DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
- 蛍光観察
洗浄・検出（ハプテン標識プローブ）
- ２×SSC中５分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
- 50％ホルムアミド／２×SSC中、37℃、20分浸漬（ヒトＸＹプローブ・ラットＹプローブの場合46℃）
- １×SSC中15分浸漬
- Blocking溶液にて30分間Blocking（5% milkまたは1% BSA in ４×SSCなど ）
- 蛍光標識avidinもしくは蛍光標識streptavidin ／blocking溶液で30分?１時間反応
- 0.1% Nonidet P-40 (0.05% Tween20)／４×SSCで10分×２回、４×SSCで10分×1回洗浄
- DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
- 蛍光観察
