BACプローブ・
XY染色体FISHプローブ
FISHプロトコル

試薬

  • FISHプローブ
  • ホルムアミド
  • エタノール
  • パラホルムアルデヒド
  • ペプシン

切片の前処理

(凍結切片)

  1. 切片を室温に戻し、氷冷4%PFA/PBSで30分固定 PBSで十分に洗浄
  2. 0.02%〜0.5%ペプシン/0.1N塩酸溶液中で37℃、1分〜30分反応
  3. PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥

(パラフィン包埋切片)

  1. 脱パラ
  2. 2×SSC中5分浸漬
  3. 2×SSC中、10分間電子レンジで加熱
  4. PBS中で放冷 0.02%〜0.5%ペプシン/0.1N塩酸溶液中で37℃、1分〜30分反応
  5. PBSで洗浄 アルコールシリーズにより脱水・乾燥

ハイブリダイゼーション

  1. 切片にプローブをアプライしカバーグラスをかける
  2. 凍結切片80℃、パラフィン切片80〜90℃のホットプレート上で10分間加熱し変性処理する
  3. 湿潤箱で37℃でovernightハイブリダイズさせる

洗浄・検出(ダイレクト蛍光標識プローブ)

  1. 2×SSC中5分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
  2. 50%ホルムアミド/2×SSC中、37℃、20分浸漬
  3. 1×SSC中15分浸漬
  4. DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
  5. 蛍光観察

洗浄・検出(ハプテン標識プローブ)

  1. 2×SSC中5分浸漬しカバーグラスを静かにはずす
  2. 50%ホルムアミド/2×SSC中、37℃、20分浸漬
  3. 1×SSC中15分浸漬
  4. Blocking溶液にて30分間Blocking(5% milkまたは1% BSA in 4×SSCなど )
  5. 蛍光標識avidinもしくは蛍光標識streptavidin /blocking溶液で30分〜1時間反応
  6. 0.1% Nonidet P-40 (0.05% Tween20)/4×SSCで10分×2回、4×SSCで10分×1回洗浄
  7. DAPI染色後マウントもしくはDAPI入りマウント剤でマウント
  8. 蛍光観察
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